人外周血TH1/TH2/TH17染色

Tips：采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管，刺激劑盡量選用凍干粉自己配置；cocktail刺激劑是液體形式，PMA會因保存不當導(dǎo)致活性降低，影響刺激效果，而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定，可以保證刺激效果。

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測

細胞刺激：（刺激體系1ml）

取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內(nèi)，加入800 ml的*培養(yǎng)基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時。

流式檢測：

1、收集細胞于流式管內(nèi)，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應(yīng)的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；

2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋），旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟 失），彈散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時加入相應(yīng)的細胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；

7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細胞，并上機檢測并分析。

Tips：1、根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)的抗體，并做單染管用于調(diào)節(jié)補償（具體如何設(shè)置單染管，可參照后文中補償章節(jié)的介紹）。

     2、盡量做同型對照，因細胞因子表達量不高（尤其是IL-4表達量非常低），細胞因子抗體對應(yīng)的同型對照一般都要做。

     3、PMA刺激會導(dǎo)致人T細胞表面CD4表達的下調(diào)，PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯，4h刺激后會下調(diào)50%以上，6h刺激幾乎檢測不到CD4，因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細胞。

     4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對細胞損傷較大，建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液，在加入破膜劑，這樣會減少對細胞的損傷（形成的細胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結(jié)果

注意：細胞破膜后對形態(tài)影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

流式方案BioGems*資料。

背景知識

TH1/TH2/TH17細胞[3]

Th細胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答主要參與者。傳統(tǒng)觀念根據(jù)Th細胞分泌的細胞因子不同將其分為兩型：一型能產(chǎn)生IFN-г的Th1細胞，在介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答中起重要作用；另一型能產(chǎn)生IL-4的Th2細胞，它們與體液免疫應(yīng)答有關(guān)。Th1／Th2細胞由共同前體細胞即CD4+T細胞分化而來，CD4+T細胞活化后，在IL-l2的作用下向Thl細胞分化。IL-l2是CD4+T細胞分化為Th1細胞的決定因子。IL-l2與IL-12R結(jié)合后誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT4分子的活化，可上調(diào)IFN-г，進而活化STAT1分子，并誘導(dǎo)Th1細胞分化特異性地轉(zhuǎn)錄因子T-bet?；罨腃D4+T細胞在IL-4作用下向Th2細胞分化。

Th 17細胞是一型zui近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞，主要分泌IL-17A(即IL-17)，與炎性反應(yīng)和自身免疫疾病有關(guān)?；罨腃D4+T細胞在IL- 21或IL-6與TGF-β的共同作用下，經(jīng)STAT3通路激活視黃酸相關(guān)孤兒核受體(ROR)-гt和ROR-α，zui終分化為Th17細胞。

PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)是一種佛波酯，常用于激活某些類型的蛋白激酶C(PKC)，如group A (α, βI, βII, γ) 和group B (δ, ε, η, θ)異構(gòu)體。佛波酯(包括PMA)的結(jié)構(gòu)類似于二酰基甘油，可通過與PKC的C1域相互作用而活化PKC異構(gòu)體。通過PCK，PMA也活化某些MAP激酶途徑。PMA高濃度長時間作用于細胞可引起總PKC活性及其成瘤性的降低，而低濃度可能起保護作用。此外，PMA也促進造血分化。PMA的水溶性約是PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate)的10倍，提示PMA更適合用于細胞學(xué)研究。

Ionomycin 離子霉素是Streptomyces conglobatus細菌生成的一種離子載體。用來提高胞內(nèi)鈣離子濃度，了解鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運機制。也可用于刺激以下胞內(nèi)因子產(chǎn)生：干擾素，穿孔素 ，IL-2和 IL-4，一般和佛波酯聯(lián)合使用。這些細胞因子在炎癥反應(yīng)中有重要作用。

Brefeldin A布雷菲爾德菌素A通過間接阻止COP-I與高爾基膜的連接，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。

引用

1 BioGems*資料

2 Wiki

3 《Th1、Th2、Th17和Treg研究現(xiàn)狀》 張文林

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